การเชื่อมต่อชิ้นส่วน DNA กับ cloning vector เพื่อให้ได้ recombinant DNA

การเชื่อมต่อ (ligation) ชิ้นส่วน DNA กับ DNA พาหะให้ได้ rDNA (recombinant DNA) จะทำได้โดยใช้เอนไซม์เชื่อมต่อ คือ เอนไซม์ ligase ซึ่งมีอยู่หลายชนิด แต่ที่นิยมใช้คือ T4 DNA ligase เอนไซม์นี้จะสามารถเชื่อมต่อ DNA สายคู่ โดยสร้างพันธะฟอสโฟไดเอสเตอร์ ระหว่างปลาย DNA ที่มีหมู่ 5’ phosphate กับหมู่ 3’ hydroxyl end ซึ่งเอนไซม์ ligase นี้จะสามารถเชื่อมต่อได้ไม่ว่าปลายของสาย DNA สายคู่นั้นจะอยู่ในรูปที่เป็น sticky end (ปลายสาย DNA สายคู่นี้มีสาย DNA ที่อาจเป็นปลาย 5’ หรือ 3’ ยื่นออกมา) หรือ blunt end (คือ ปลาย DNA มีcomplementary base เสมอกันไม่มีนิวคลีโอไทด์ใดๆ ยื่นออกมา) ในการเชื่อมต่อด้วย ligase จะเชื่อมต่อปลาย blunt end เข้าด้วยกันได้ในทุกกรณีไม่ว่า blunt end นั้นจะเกิดมาจากวิธีการใด ตราบใดที่มีหมู่ 5’ phosphate และหมู่ 3’ hydroxyl end แต่ในกรณีที่ปลายเป็น sticky end นั้น ligase จะเชื่อมต่อได้เมื่อเบสปลายทั้งสอง complementary กันเท่านั้น