เทคนิคในการหา DNA sequence

เทคนิคในการหา DNA sequence นั้นมีการพัฒนาขึ้นตั้งแต่ปี 1970 โดยมี 2 วิธี ด้วยกัน คือ

วิธีที่หนึ่ง พัฒนาขึ้นโดย Allan Maxam และ Walter Gilbert โดยใช้สารเคมีตัดสาย DNA ที่ตำแหน่งต่างๆ กัน วิธีนี้เรียกว่า Maxam-Gilbert sequencing ส่วนอีกวิธีหนึ่งนั้นเรียกว่า dideoxy sequencing หรือ Sanger sequencing ซึ่งพัฒนาขึ้นมาโดย Fred Sanger โดยวิธีการใช้ enzyme มาต่อสาย DNA จาก primer ในปัจจุบันวิธี dideoxy เป็นวิธีที่นิยมใช้มากที่สุด วิธีการหาลำดับเบสนั้นได้รับการพัฒนามาตลอด จนปัจจุบันนี้สามารถทำได้ง่าย และไม่ซับซ้อนยุ่งยากนัก การหาลำดับเบสนี้เป็นประโยชน์อย่างมากในการศึกษายีนต่างๆ ทั้งในคน สัตว์ และพืช โดยในคน human genome project เป็นโครงการที่จะศึกษาลำดับเบสทั้งหมดของคน ซึ่งได้เริ่มและดำเนินการติดต่อกันมาหลายปีแล้ว

Maxam-Gilbert DNA Sequencing

เป็นวิธีการที่ใช้ปฏิกิริยาทางเคมีที่จะตัดสาย DNA ที่ตำแหน่งจำเพาะ โดยที่สำคัญ DNA ที่เราจะนำมาทำการหาลำดับเบสนั้นจะต้องเป็น DNA ชนิดเดียวกัน และมีขนาดประมาณ 200-1000 bp ในตัวอย่างนี้ เราจะทำการหาลำดับเบสของสาย DNA ขนาด 10 bp

ขั้นตอนต่างๆ ในการหาลำดับ nucleotide โดยวิธี Maxam-Gilbert มีดังนี้ คือ

ขั้นที่ 1 ติดฉลากสาย DNA ด้วยสารกัมมันตภาพรังสี (P32) โดยแต่ละ strand ของ double-stranded DNA จะถูกติดฉลากที่ปลาย 5’ หรือ 3’ จากนั้น DNA นั้นจะถูกนำมา denature ให้เป็น single strand โดยที่ในแต่ละ strand จะถูกติดฉลากที่ปลายข้างหนึ่งข้างใดเท่านั้น
ขั้นที่ 2 การตัดสาย DNA
โดยในขณะนี้ สาย DNA จะมีลักษณะเป็น 32P 5’ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 3’

DNA จะถูกแบ่งเป็น 4 ส่วน แต่ละส่วนจะถูกนำมาทำปฏิกิริยาเคมีที่ต่างกัน โดยจะทำการตัดสาย DNA นั้นที่ตำแหน่งของ base 1 ใน 4 นั้นๆ เช่น ในส่วนที่ 1 จะถูกนำไปทำปฏิกิริยาทางเคมี โดยจะตัดที่ตำแหน่งที่มี base เป็น T หรือ C เท่านั้น สำหรับส่วนที่กำหนดให้ตัดที่ตำแหน่ง G นั้น จะตัดที่ตำแหน่ง A ด้วย แต่จะตัดที่ตำแหน่งที่เป็น G มากกว่า ในทำนองเดียวกัน ส่วนที่ถูกกำหนดให้ตัดที่ตำแหน่ง A จะตัดที่ G ด้วย แต่จะตัดที่ตำแหน่ง A มากกว่า
ขั้นที่ 3 เป็นการแยกขนาดของ DNA ที่ได้จากการทำปฏิกิริยาทางเคมีตามขั้นตอนที่ 2 DNA ที่ได้จะถูกนำมาแยกขนาดตามความยาวของเบสโดยใช้วิธี polyacrylamide gel electrophoresis (เหมือนกับ agarose gel electrophoresis เพียงแต่ว่า polyacrylamide gel สามารถที่จะใช้แยกขนาดของ DNA ที่ต่างกันเพียงแค่ 1 bp ได้)

Dideoxy (Sanger DNA sequencing)

เช่นเดียวกับ Maxam-Gilbert sequencing โดยที่การหาลำดับเบสด้วยวิธีนี้ต้องการ DNA ที่เป็นชนิดเดียวกัน ซึ่งเป็น DNA สายคู่ที่จะถูก denature ให้เป็นสายเดี่ยวโดยใช้ความร้อน และ oligonucleotide สายสั้นๆ ซึ่ง complementary กับ DNA ส่วนที่ใกล้เคียงกับลำดับเบสที่เราต้องการทราบ (sequencing primer) โดยที่จะ anneal กับสาย DNA สายเดียวเท่านั้น

oligonucleotide primer จะถูกออกแบบให้ด้าน 3’ อยู่ใกล้กับส่วนของ DNA ที่เราต้องการทราบลำดับของเบส โดย oligonucleotide นี้ จะทำหน้าที่เป็น primer เพื่อให้มีการสังเคราะห์ DNA สายที่ complementary กับ DNA template ต่อไป

จากนั้น DNA ที่ anneal กับ oligonucleotide primer แล้ว (เราเรียก DNA ที่ต้องการจะหาลำดับเบสนี้ว่าเป็น template หรือ DNA template) จะถูกแบ่งเป็น 4 ส่วนแต่ละส่วนจะมี normal precursors ของ DNA เช่น dATP, dTTP, dCTP, dGTP และ DNA polymerase และ ตัว precursor นี้จะถูกติดฉลากด้วยสารกัมมันตภาพรังสี (32P) เพื่อที่จะสามารถตรวจสอบสาย DNA ที่สร้างใหม่ ใน DNA แต่ละส่วนนั้นจะต่างกันที่จะใช้ modified nucleotide คือ dideoxy nucleotide ต่างชนิดกัน dideoxy nucleotide กับ deoxynucleotide นั้น จะต่างกันที่ dideoxy nucleotide มี 3’-H ที่ deoxyribose sugar แทนที่ 3’-OH ถ้าเราใช้ dideoxy nucleotide ในขบวนการสังเคราะห์ DNA dideoxy จะเข้าไปใน สาย DNA ที่กำลังสังเคราะห์อยู่ได้ แต่สาย DNA นั้น จะไม่สามารถที่จะสังเคราะห์ให้มีความยาวต่อไปได้อีก การสังเคราะห์ DNA สายนั้นก็จะหยุด เพราะเหตุว่าการที่ไม่มี 3’-OH จะป้องกันการเกิด phosphodiester bond กับ 5’P ของ DNA precursor ตัวที่จะเข้ามาใหม่ sequencing reaction แต่ละส่วนจะมี ddATP หรือ ddCTP หรือ ddTTP หรือ ddGTP อย่างใดอย่างหนึ่งร่วมกับมี normal precursor ทั้ง 4 ชนิดคือ dATP dTTP dCTP และ dGTP ในการสังเคราะห์ DNA สายใหม่ จะมีการใช้ทั้ง dd NTP และ d NTP แบบสุ่มตัวอย่าง แต่โดยทั่วไป dideoxy จะมีปริมาณ 1 ใน 100 ของ normal precursors ดังนั้นส่วนใหญ่ก็จะมีการใช้ deoxynucleotide เหมือนเช่นการสังเคราะห์ DNA ตามปกติ ซึ่ง primer ก็จะถูกต่อโดย DNA polymerase โดยมีลำดับเบสที่ complementary กับ template ถ้า dideoxynucleotide ถูก incorporate เข้าไปในสาย DNA ที่กำลังสร้างอยู่ การสร้าง DNA สายนั้นก็จะหยุดลงไม่สามารถสร้างต่อไปได้อีก ส่วนสายที่มี deoxynucleotide incorporate เข้าไป ก็สามารถสังเคราะห์ไปได้เรื่อยๆ จนกว่าจะ incorporate dideoxynucleotide เข้าไป

ดังนั้น DNA สายใหม่ที่กำลังสร้างอาจจะหยุดได้ทุกตำแหน่งที่มีการ incorporate dideoxynucleotide เข้าไป เช่น ใน ddA reaction สายใหม่ขนาดต่างๆ ที่ถูกสร้างเหล่านี้ จะมีปลายสุดท้ายเป็น ddA เสมอ ในขณะเดียวกัน ddG ddC ddT reaction ก็จะมี DNA สายใหม่ที่มีเบสสุดท้ายเป็น ddG, ddC และ ddT ทั้งสิ้น จากนั้นสาย DNA จะถูกนำมาแยกขนาด โดย polyacrylamide gel elctrophoresis แล้วนำไปประกบกับฟิล์ม x-ray ซึ่งเมื่อนำมาล้างและ develop แล้ว จะสามารถมองเห็นสาย DNA ได้โดย autoradiogram