Restriction Endonuclease

โมเลกุลของ recombinant DNA (DNA สองโมเลกุลมาเชื่อมต่อกัน) จะไม่สามารถเกิดได้โดยไม่มีการใช้ restriction endonuclease (หรือ restriction enzyme) ซึ่งสามารถตัด double stranded DNA ที่ตำแหน่งของเบสที่จำเพาะ ซึ่งเรียกว่า restriction site

restriction enzyme แต่ละชนิดมีชื่อตาม organism และ strain ที่สกัดเอนไซม์ได้ เช่น BglII มาจาก Bacillus globigi, EcoRI มาจาก E. coli strain RY 13 และ HindIII มาจาก Haemophilus influenzae strain Rd. เป็นต้น

Restriction enzyme แบ่งได้เป็น 2 ชนิด คือ

Type I restriction enzyme จะตัดสายคู่ของ DNA (โดยไม่จำเพาะเจาะจงลำดับเบส) ที่อยู่ใกล้เคียงกับตำแหน่งที่มีลำดับเบสจำเพาะต่อ enzyme ชนิดนั้น เนื่องจาก Type I นี้ ตัดที่ตำแหน่งของ DNA ที่ไม่จำเพาะลำดับเบส เอนไซม์ชนิดนี้จึงไม่ค่อยเป็นประโยชน์ในทาง recombinant DNA technology เท่าใดนัก

Type II restriction enzyme จะตัด DNA สายคู่ที่ตำแหน่งที่มีลำดับเบสจำเพาะเจาะจง สำหรับ enzyme นั้นๆ โดยตัดภายในลำดับเบสนั้น

restriction site สำหรับ restriction enzyme type II นั้น จะมีแกนที่สมมาตร (symmetry) กันอยู่ที่จุดกึ่งกลาง ดังนั้นลำดับเบสจาก 5’ ไป 3’ ของ DNA สายหนึ่งจะเหมือนกับลำดับเบสจาก 5’ ไป 3’ ของ DNA สายที่ complement กัน ลักษณะการเรียงตัวแบบนี้เรียกว่า “palindrome”

restriction site ที่พบบ่อยจะมีจำนวนคู่เบสเป็น 4 หรือ 6 แต่ก็พบว่ามีของเอนไซม์ที่มีจำนวนเป็น 5 และ 8

restriction enzyme จะตัด DNA ที่พันธะระหว่าง 3’ carbon ของ deoxyribose sugar และ phosphate ของ deoxyribose ตัวถัดไป ดังนั้น สาย DNA ที่ถูกตัดด้วย restriction enzyme จะมี phosphate ที่ 5’ และ hydroxyl group ที่ปลาย 3’

blunt end ปลายสาย DNA เส้นคู่ที่มีลักษณะเสมอกัน ไม่มี nucleotide ใดๆ ยื่นออกมา
sticky end ปลายสาย DNA เส้นคู่ที่มีสาย DNA ที่อาจเป็นปลาย 5’ หรือ 3’ ยื่นออกมา ทำให้ปลายไม่เสมอกัน